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3. CRISPR-Cas系统能够抵抗外来DNA入侵的假设在2007年得到证实[14]。在一组巧妙的实验中，科学家们研究了一种嗜热链球菌的2级系统，他们用毒性噬菌体感染了这种链球菌。其次，分离抗感染细菌并分析其CRISPR位点。实验表明，抗性细菌获得了新的间隔序列，这些间隔序列与感染噬菌体内用于选择抗性的序列相匹配。间隔区的缺失导致了耐药性的丧失，能够在耐药细菌上生长的噬菌体在噬菌体基因组中积累了原间隔区序列的突变。此外，Cas基因（Cas5）失活导致噬菌体抗性丧失。因此，实验证明了Cas基因产物在CRISPR-Cas介导免疫中的作用，并且系统的特异性依赖于间隔序列[14]。

对CRISPR-Cas功能的进一步深入研究来自于对大肠杆菌的研究，该大肠杆菌包含一个编码不少于8种不同Cas蛋白的1类CRISPR-Cas系统。其中五种基因产物可以被纯化为一种称为级联（CRISPR相关抗病毒防御复合物）的多蛋白复合物。Cascade被证明在前crRNA处理中起作用，在重复区域切割长转录物，从而产生包含病毒衍生序列的较短的crRNA分子[15]。裂解后，成熟的crRNA分子被级联保留，并在Cas编码的解旋酶Cas3的辅助下作为引导分子，使Cascade能够干扰噬菌体的增殖。结果表明CRISPR的功能有两个不同的步骤：第一，CRISPR的表达和crRNA的成熟；第二，需要Cas3蛋白的干扰步骤。这一结果还提供了证据，表明大肠杆菌CRISPR-Cas系统的目标是噬菌体DNA而不是RNA，因为与两条DNA链互补的crRNA可能会干扰噬菌体的增殖[15]。DNA是CRISPR-Cas干扰靶点的确凿证据来自一种表皮葡萄球菌菌株的巧妙实验，该菌株包含一个CRISPR阵列，其间隔序列与接合质粒中的基因同源[16]。只有当间隔序列发生突变或删除时，质粒才会转移到菌株中。在质粒的靶序列中插入一个自剪接内含子。这样一来，CRISPR间隔区就不再是DNA的补充了，因为它被内含子破坏了，而是与RNA互补，后者将被剪接，重建敏感靶点。事实上，插入自剪接内含子就足以克服CRISPR-Cas对质粒转移的抑制，强烈地暗示DNA是主要靶点[16]。这一结论进一步得到嗜热链球菌研究的支持，在研究中，CRISPR-Cas系统在体内可同时裂解噬菌体和质粒DNA[17]。如果间隔区导致DNA与匹配序列的切割，他们如何避免自己的CRISPR间隔区切割？这个问题的答案来自于对原间隔区序列的研究，即噬菌体基因组中产生间隔区的序列。短序列基序仅与原间隔序列相距数个核苷酸[11,18]。这些基序后来被标记为原间隔相邻基序或PAMs[19]。通过噬菌体对嗜热链球菌CRISPR编码抗性的研究，PAMs的功能重要性变得更加明显。在这些研究中，分离并分析了克服细菌耐药性的噬菌体。这些研究表明，许多对CRISPR免疫有抵抗力的人在PAMs中获得了突变，这意味着这些短序列对于靶向性很重要[20]。后来的研究表明，PAM序列对于靶干扰和将新的间隔序列吸收到CRISPRs中都是必需的[21,22]。

4. 到2011年，很明显，CRISPR-Cas系统在原核生物中广泛存在，并作为适应性免疫系统发挥作用，对抗入侵的噬菌体和质粒（图1）。研究还证实了Cas蛋白在三个不同的水平上发挥作用：（i）将新的间隔区DNA序列整合到CRISPR基因座中，（ii）crRNA的生物发生，以及（3）对入侵核酸的沉默[23，24]。CRISPR-Cas9作为基因组编辑工具的鉴定来自嗜热链球菌2类，II型CRISPR-Cas系统和相关的人类致病菌链球菌的研究。这个系统包含四个Cas基因，其中三个（Cas1、Cas2、csn2）参与间隔区的获取，而第四个Cas9（原名Cas5和csn1）干扰必须的[14]。为了支持这一观点，Cas9基因的失活阻止了靶DNA的断裂[17]。为了进一步确定免疫所需的元素，嗜热链球菌CRISPR-Cas系统被引入大肠杆菌中，在大肠杆菌中它提供异源保护，防止噬菌体和质粒感染[25]。利用这个实验模型，系统的部分被灭活，以确定保护所需的组件。这项工作清楚地表明，仅Cas9蛋白就足以完成CRISPR编码的干扰步骤，并且蛋白质中存在的两个核酸酶域，HNH和RuvC，足以达到这种效果[25]。

5. 2011年，Emmanuelle Charpentier及其同事报告了化脓链球菌中crRNA成熟的机制[27]。他们利用差异RNA测序来描述小的非编码RNA分子，基于前crRNA和成熟crRNA分子的表达，鉴定了一个活跃的CRISPR基因座。出乎意料的是，测序工作还发现了大量的RNA物种，转录自CRISPR基因座上游210 bp的区域，在CRISPR阵列的相反链上（图2a）。转录本表示为反式编码的小RNA（tracrRNA），包含一段25个核苷酸（nt），与CRISPR位点的重复区域几乎完全互补（1-nt不匹配），因此可以预测与前crRNA的碱基配对[27]。将形成的RNA双链区包括pre-crRNA和tracrRNA的加工位点，这立即表明这两个RNA在配对时可以协同加工（图2b）。为了支持这个想法，tracrRNA位点的删除阻止了crRNA前的处理，反之亦然。Charpentier和他的同事们还注意到，一个涉及tracrRNA和pre-crRNA的共处理双工体会有短的3′悬垂，类似于endoribonuclease RNase III所产生的，他们进一步证明这种酶可以在体外处理tracrRNA和pre-crRNA之间形成的异源双链，这是tracrRNA和pre-crRNA在体内加工所必需的。最后，研究人员发现加工过程也涉及到Cas9蛋白，因为细菌中Cas9基因的缺失会损害tracrRNA和前crRNA的处理。根据他们的发现，Charpentier和他的同事认为Cas9蛋白作为一种分子锚，促进tracrRNA和pre-crRNA之间的碱基配对，这反过来又允许宿主RNase III蛋白识别和切割[27]。以前的报道已经揭示了Cas9对干扰的重要性。Charpentier和Jennifer A.Doudna发起了一项合作，研究crRNA是否可以用于指导核酸酶的序列特异性。在这一点上，两位科学家有了一个至关重要的发现。在体外反应中加入tracrRNA触发Cas9裂解靶DNA分子。因此，tracrRNA有两个关键功能：通过RNase III酶触发前crRNA处理，然后通过Cas9激活crRNA引导的DNA切割。

在一系列体外生物化学实验中，研究人员调查了反应的生化机制[28]。Cas9中的两个核酸酶域，HNH和RuvC，分别能切割一条靶DNA。裂解发生在PAM序列上游3bp处，化脓链球菌的PAM序列为5′-NGG-3′，N对应于四种DNA碱基中的任何一种。此外，正如之前的报告所预测的，靶点识别和切割被PAM序列的突变所抑制[20]。PAM序列依赖性的一个特殊方面是双链DNA的断裂对互补链和非互补链的突变都很敏感，而单链DNA靶点的断裂不受PAM基序突变的影响。这些观察结果使作者得出结论，PAM基序可能需要duplex解开[28]。类似的发现也发表在另一份报告中，使用相关的CRISPR-Cas系统对嗜热链球菌进行研究。与Charpentier和Doudna的工作一样，本报告还证明了Cas9在原间隔区内裂解，裂解特异性由crRNA序列决定，Cas9内的两个核酸酶域，每一个裂解一条链。然而，研究人员没有注意到tracrRNA对靶DNA序列特异性切割的关键重要性[29]。在他们的研究中，Charpentier、Doudna和他的同事们还致力于描绘tracrRNA和crRNA的区域，这些区域是Cas9催化裂解靶DNA所必需的。这导致了tracrRNA中一个激活结构域的识别，并意识到靶链PAM近端区域中∼10nt的“种子区”对于目标识别尤其重要。基于他们的体外生化分析，作者假设Cas9催化DNA裂解所需的两个RNA分子的结构特征可以被单个RNA分子捕获。在一项关键的实验中，他们证明了这一点是可能的：Cas9复合物的RNA成分（crRNA和tracrRNA）可以融合在一起，形成一个活性的嵌合单导RNA分子（sgRNA）。此外，Charpentier和Doudna证明，嵌合sgRNA的序列可以改变，这样CRISPR-Cas9可以靶向感兴趣的DNA序列，唯一的限制是靶DNA附近存在PAM序列。因此，他们创造了一种简单的双组分核酸内切酶，它含有sgRNA和Cas9，可以被编程来任意切割DNA序列。他们没有忘记这一发现的重要性。在报告他们发现的论文摘要中，作者写道：“我们的研究揭示了一个使用双核糖核酸酶进行位点特异性DNA切割的内切酶家族，并强调了利用该系统进行RNA可编程基因组编辑的潜力”[28]。

原文链接：

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