cas14 cas(cas14 cas现场版)

近期，来自上海科技大学的季泉江教授研究团队系统地描述了一种微型 V-F 效应蛋白 AsCas12f1 的生化特性以及潜在的应用，并在 Nature Chemical Biology 期刊发表了题为：Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease 的研究论文。

该报道发现了一种来自嗜热菌 AsCas12f1 的微型核酸酶 AsCas12f1，以及其靶向 dsDNA 识别和切割机制，并验证分析其在细菌和人体中的基因编辑作用。

通常来说，CRISPR–Cas 反应过程包含三个阶段：获取并整合外源基因(adaptation), 转录 CRISPR 序列(expression)，以及剪切靶基因 (interference)。

在普遍的 CRIPPR-Cas 系统中，对 PAM 的特异性识别是 Cas 核酸酶靶向剪切 dsDNA 的前提。因此，论文作者首先验证 CRISPR-AsCas12f1 对 PAM（protospacer-adjacent motif）具有特异性识别作用，他们利用一个含有大量随机PAM序列的质粒库来转化具有 CRISPR-AsCas12f1 system 表达能力的大肠杆菌，通过高通量测序技术发现 AsCas12f1 对PAMs 的 5′-NTTR 位点具有最高的识别效率。紧接着使用 small RNA-seq 技术检测到 45-48nt 大小的成熟 crRNA 以及 38–144-nt 的 tracrRNA 表达。尺寸排除色譜法（ analytical size-exclusion chromatography (SEC)）检测到 AsCas12f1 和 crRNA ，tracrRNA 构成一个 RNP 复合物。AsCas12f1 通过在 PAM 近端段创建一个大约 11nt 长的 5‘TS 悬垂和 pam- 远端节段的一个近钝端来不对称切割 dsDNA。

除了 dsDNA 的裂解活性外，大多数 Cas12 核酸酶还具有 ssDNA 的裂解能力。AsCas12f1 也以 PAM 独立的方式切割 ssDNA 底物，其 DNA 断裂位点与 dsDNA 的断裂位点相同。AsCas12f1 还通过核苷酸将 PAM 远端游离 ssDNA 端从 3 ‘裁剪到 5’ 核苷酸，产生了时间依赖的阶梯状模式。此外，AsCas12f1 具有靶标激活的 ssDNA 裂解活性。

图 | AsCas12f1 核酸酶的功能验证（来源：Nature Chemical Biology ）

为了探索 CRISPR–AsCas12f1 对基因组是否具有可编辑性，作者先后在细菌和人细胞做了基因编辑能力的验证。

图 | AsCas12f1 介导的细菌基因组编辑（来源：Nature Chemical Biology ）

在 AsCas12f1 核酸酶介导的细菌基因组编辑中，作者引入了 lambda-red 重组酶来辅助同源定向修复（HDR），并补充了合成的单链供体寡核苷酸（ssODNs）作为修复模板，实验结果发现 AsCas12f1 删除了大肠杆菌中大小为 136bp 的 hisD 片段，从未破坏了组氨酸合成，导致大肠杆菌产生营养缺陷表型；同时，另一个大小为 236bp 的 cyaA 片段也被检测到删除，导致减缓了大肠杆菌的有氧生长。这些结果证明了 AsCas12f1 在体内基因组编辑方面的潜力。

图 | AsCas12f1 促进了人类细胞的基因组编辑（来源：Nature Chemical Biology ）

紧接着，研究团队又在人源细胞系上作了编辑功能的验证。在 HEK293 细胞中，通过递送表达 NLs-AsCas12f1-NLs 的质粒及其 sgRNA 或 RNP，进行了内源性基因破坏实验。基于该质粒的基因破坏实验也能有效地应用于其他人源细胞系，如 HepG2 和 Huh-7。

为进一步验证 AsCas12f1 核酸酶是否能弥补 Cas9 等核酸酶的应用缺点，作者还将 hu6 驱动的 sgRNA 盒和巨细胞病毒（CMV）驱动的 NLS-AsCas12f1-NLS-P2A-EGFP 表达盒包装成单个 AAV 载体，并有效地将 CRISPR-AsCas12f1 系统转导到人类细胞（HEK293, U-2 OS,Huh-7）中，结果成功诱导了所有三种细胞系中 VEGFA 和 PDCD1 基因的缺失突变，最大编辑效率为 11.5%。