新冠病毒（SARS-CoV-2）在全球范围内大肆传播，新冠变异株的流行使疫情防控更具挑战。快速筛查是控制疫情传播最有效的手段。RT-qPCR是目前新冠病毒的检测金标准。该方法特异性强、灵敏度高，但是由于其依赖实验室专业仪器和专业人员操作，存在耗时长等问题（从采样到出结果大致需要6小时），难以应对病毒惊人的传播速度。因此，亟须研发一种具备高灵敏度、高特异性、操作便捷且快速的核酸检测方法。
2022年3月21日，武汉大学医学研究院/教育部免疫与代谢前沿科学中心殷昊教授和张楹教授课题组合作在Nature Biomedical Engineering上发表了题为 Fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 RNA using suboptimal protospacer adjacent motifs for Cas12a的研究论文。研究者首次靶向非经典PAM建立了兼具快速（15-20分钟）、灵敏（和qPCR相当）、稳定和特异的核酸检测一步法（sPAMC），并在SARS-CoV-2真实样本中达到94.2%准确度并无一例假阳性。sPAMC技术仅需20分钟就能检测到Ct值为35.8的新冠真实样品，并且用便携式紫外灯或蓝光灯照射即可观察到结果。
CRISPR/Cas系统不仅用于基因编辑，也被研发为核酸检测工具。Cas12和Cas13特异性切割双链DNA底物（顺式切割）后，会激活其非特异性切割单链DNA或RNA的能力（反式切割）【1-5】。CRISPR特异性由两部分共同决定，一部分是crRNA和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas蛋白复合体和位于靶DNA旁的短序列形成非共价结合，后者被称为PAM (Protospacer Adjacent Motif)。当Cas12搜寻到底物上的PAM序列，在crRNA和靶DNA碱基配对之后，进而特异性切割dsDNA，随后激活其反式切割能力，快速降解单链DNA报告系统，释放出的荧光信号。新冠病毒检测的两步法（SHERLOCK和DETECTR）先通过等温扩增富集待检的核酸片段，再加入CRISPR/Cas切割体系产生信号。虽然两步法兼具高特异性、高灵敏度等优点，却增加了操作复杂度和引入交叉污染等问题【6-7】。STOPCovid是在两步法基础上优化出的一步检测法，即在一个反应试管中同时进行样品扩增和切割反应，虽然简化了操作步骤并降低交叉污染风险，但灵敏度显著低于两步法，且需要约45分钟至1小时左右的反应时间【8-9】。
研究者们致力于研发能满足快速简便、灵敏特异的一步法核酸检测新方法。通过比较新冠病毒序列中四个位点的非经典PAM (VTTV,TVTV, VTTV) 和经典PAM (TTTV) 的反式切割活力和一步法效率，发现和经典PAM相比，非经典PAM显著加快检测速度，将灵敏度提高了10-100倍，大幅度提升信号的稳定性。进一步探索机制发现：在一步法反应中，等温扩增和CRISPR检测存在竞争关系。当Cas12a遇到经典PAM时，由于切割能力过强，等温反应扩增出来的目的片段被快速消耗，难以达到指数扩增，导致底物无法有效富集，荧光信号延迟产生且不稳定；而对于非经典PAM介导的一步法，Cas12a和底物的结合能力弱。在反应初期，等温扩增占据主导地位，快速富集足够的底物，为反应后期Cas12a切割和荧光释放奠定前期基础。
图1. 非经典和经典PAM介导的一步法快检方法概览图
研究者们将非经典PAM介导的一步法检测技术命名为sPAMC (for suboptimal PAM of Cas12a-based test with enhanced flexibility, speed, sensitivity, and reproducibility)，并将sPAMC应用到SARS-CoV-2真实样品检测。研究者们共检测了204个咽拭子样本，在104个RT-qPCR阳性样本中，sPAMC 能检出98个，剩余的100个阴性样本均未检出，证明了sPAMC 有94.2%的检出率且无假阳性。sPAMC技术仅需20分钟就能检测到Ct值为35.8的新冠真实样品，并且仅用便携式紫外灯或蓝光灯照射即可观察到结果。
非经典PAM的快检方法sPAMC 相比于传统一步法有如下优点：1）检测速度提高2-3倍，可以实现在10-15分钟内检测出DNA病毒，15-20分钟内检测出RNA病毒；2）荧光信号结果在样本间的可重复性高，荧光信号波动少于30%；3）检测灵敏度提高，与qPCR一致; 4) 极大地拓宽了靶向的检测位点可选择性，可选择的非经典PAM组合为经典PAM的7倍以上。研究者首次提出了通过靶向非经典PAM，降低Cas12a的顺式和反式切割速率的方法来实现核酸检测，为开发建立更快更灵敏的CRISPR核酸检测方法提供了新思路。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41551-022-00861-x
制版人：十一
参考文献
1 Chen, J. S. et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science 360, 436-439 (2018).
2 Teng, F. et al. CDetection: CRISPR-Cas12b-based DNA detection with sub-attomolar sensitivity and single-base specificity. Genome biology 20, 1-7 (2019).
3 East-Seletsky, A. et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection. Nature 538, 270-273 (2016).
4 Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356, 438-442 (2017).
5 Myhrvold, C. et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science 360, 444-448 (2018).
6 Broughton, J. P. et al. CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature biotechnology 38, 870-874 (2020).
7 Patchsung, M. et al. Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA. Nature biomedical engineering 4, 1140-1149 (2020).
8 Joung, J. et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing. New England Journal of Medicine 383, 1492-1494 (2020).
9 Arizti-Sanz, J. et al. Streamlined inactivation, amplification, and Cas13-based detection of SARS-CoV-2. Nature communications 11, 1-9 (2020).
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