在蜜蜂中，与遗传相关的蜂群成员天生就具有蜂群特异性的表皮碳氢化合物特征，可作为信息素巢状识别线索。

然而，尽管蜂群内部的相关性很高，但单个蜂群成员固有的菌落特异性化学标记的先天发育在很大程度上取决于菌落的环境，而不是仅仅依靠巢伙伴共享的遗传变异。

因此，令人困惑的是，非基因因素如何驱动同一殖民地成员共有的定量性状的先天发展。

在这里，科学家们通过显示蜜蜂中的巢式识别提示（至少部分地由各个菌落成员之间的肠道微生物组的共有特征）来定义非基因因素，从而为这一难题提供了一种解决方案。 这些结果说明了宿主-微生物组相互作用作为动物行为特征变化的来原的重要性。

社会团体的完整性和健壮性要求个人具有可靠地认识并展现团体成员身份的线索的能力。 通过类似于多细胞生物如何在细胞和分子水平上进行自我识别以识别和防止病原体入侵的过程，动物社会团体已经发展了团体成员识别机制，以防止资源入侵等无关个体，掠食性动物，掠食者， 和寄生虫。 然而，人们对在社会团体层面上认可成员的机制还没有很好的理解。

社会昆虫群落代表着一种极端的社会生活方式，这使其成为研究调节和维持团体成员和完整性的机制的理想系统。 社交昆虫通常依赖表皮碳氢化合物（CHC）的特定于菌落的混合物作为信息素线索，表示菌落的组成。

然而，尽管菌落成员之间具有高度的遗传相关性，但许多社会昆虫物种中的巢蚁识别线索似乎是独立于菌落特异性遗传变异而定义的。

相反，它们主要由殖民地和/或共有的社会环境衍生的因素定义。 当前的模型表明，巢恋识别线索是通过“格式塔”机制产生的，个体产生CHC，然后在个体之间转移和均质化，从而每个蜂群成员均携带平均CHC谱。

但是，最近在某些物种中的证据表明，该昆虫固有地产生了特定于蜂群的CHC谱，而不是由蜂群水平的格式塔造成的。这导致蜜蜂不会迷路，也不会找不到他们的家。

可是，令人困惑的是，环境因素如何驱动固有的生物合成途径，以产生牢固的菌落特异性CHC信号，该信号由菌落成员共享，而与它们的遗传相关性无关。

在这里，科学家测试的假设是，蜂群中的菌落特异性巢式识别提示是由菌落特异性肠道微生物群落定义的。为此，科学家进行了一系列复杂的实验，得出了菌落特异性肠道微生物群落是通过遗传和环境双重因素来影响整个蜂群的发展的，且通过衡量菌群的数量来判断CHC对不同种群各种条件的蜜蜂的影响。

“ holobiont”的概念是由宿主及其微生物组组成的独特的生物实体，在动物生物学中正在成为一种重要且普遍存在的现象。

在这个概念下，种群水平的遗传变异是动物宿主及其相关微生物的基因组变异的产物。 因此，观察到的宿主表型的变化，例如识别提示，实际上可能是由微生物组的变化引起的。 对多种动物物种的研究支持共生微生物在驱动宿主化学识别线索方面的作用）。

因此，有可能来自不同社会昆虫群落的个体的化学特征差异主要是由群落水平上跨菌落的微生物群落水平引起的。 这提供了一种可能的机械解释，说明了为什么巢伴侣识别提示的发展似乎遵循遗传确定的性状的规则，却不依赖于蜜蜂群体成员之间的实际关联性。

科学家对蜜蜂进行了一系列的测验

为了开始测试是否通过特定于菌落的肠道微生物群落定义了蜜蜂群体中特定于菌落的巢状识别线索，我们通过执行16S核糖体RNA（rRNA）评估了来自不同蜜蜂菌落的觅食蜂是否具有不同的肠道微生物群落和CHC谱图 ）分别对肠样品进行测序和对表皮提取物进行气相色谱分析。 我们发现，来自不同殖民地的觅食者在整体肠道微生物群落结构上存在差异。

此外，虽然来自不同殖民地的觅食者在肠道微生物分类学多样性上有很大重叠，但它们在各个肠道微生物的丰度上确实有所不同。 接下来，我们寻求建立肠道微生物组与个体CHC谱之间的因果关系，而与蜜蜂的遗传背景无关。 为此，我们使用了一个交叉蜂巢的养育实验，在该实验中，从其两个出生地或无关的宿主菌落中培育出了来自两个不同菌落的新近封闭的蜜蜂群。 这些研究表明，与源和宿主菌落相关的因素均会导致单个蜜蜂的整体肠道微生物群落发生变化）。

但是，当我们比较单个蜜蜂的特定微生物系统型丰富度时，我们发现在四种处理之间存在显着差异的14种微生物分类中，在行为成熟过程中共享相同蜂巢环境的蜜蜂之间有6种相似，而与遗传相关性无关）。 相比之下，我们没有发现与源蜂巢环境显着相关的任何分类单元，这表明隐居后环境是确定成年工蜂肠道微生物群落的最重要因素。 总之，这些数据表明，尽管蜜蜂肠道微生物群落由一组在菌落间共有的细菌菌种核心构成，但来自不同菌落的个体表现出这些特定菌种的相对相对丰度不同，这可能导致CHC的菌落差异。

（A到C）不同殖民地的觅食蜜蜂的整体肠道微生物群落（A）和CHC谱（B）不同，但分类学丰富度（C）没有差异。 （D）来自不同菌落的觅食蜂之间的单个肠道微生物分类群的丰度不同。 （E）觅食蜂肠道微生物群落由菌落环境决定。 （A），（C）和（E）显示为非度量多维比例尺图，描绘了样本之间的BC不相似性。 （D）识别的微生物分类单元，以堆叠的条形图显示，描绘了每个菌落的觅食者肠道内与蜜蜂有关的微生物的平均相对丰度。 图例中的粗体字母表示统计意义，P <0.05（排列MANOVA后跟FDR成对对比）。 ns，不显着（ANOVA）。

为了直接测试肠道微生物组在定义单个工蜂的CHC谱图中的作用，我们接下来评估了实验性操作姐妹蜜蜂之间的肠道微生物群落是否足以驱动其CHC谱的差异。 我们首先检查了肠道微生物组通过各种整个肠道微生物群落操作在调节CHC谱中的总体作用。 正如先前针对其他昆虫的报道（一样，我们观察到抗生素处理对蜜蜂肠道菌群的影响-通过在琼脂平板上培养肠道样本确定-和CHC谱。

类似地，当将姊妹蜜蜂接种活的（完全微生物组）或热灭活的接种物时，它们会形成不同的肠道微生物群落）。 此外，由于新近封闭的蜜蜂通过与年老蜜蜂的相互作用获得肠道菌群，因此，科学家研究了从单一来源的群体中饲养日龄蜜蜂与来自不同群体的年纪较大的蜜蜂的影响。

这显示了对实验蜜蜂的整体肠道微生物群落的显着影响。 但是，当较老的蜜蜂首次接受抗生素治疗时，我们没有观察到对实验蜜蜂的CHC分布有共同影响。 此外，我们无法在这些实验蜜蜂的肠道中扩增16S rRNA基因，表明这些样品中的肠道细菌数量可忽略不计，这表明当年老的蜜蜂患有厌氧症时，实验蜜蜂无法获得微生物。 总之，这些数据表明，通过与年老蜜蜂的社交互动获得不同的肠道微生物群，足以在相关个体之间引起CHC谱差异。

蜜蜂蜜蜂接种不同的蜜蜂肠道微生物群落后会形成不同的CHC曲线

（A和B）涂有抗生素的蜜蜂肠道（A）接种时比用对照糖溶液（B）处理的蜜蜂肠道生长少。 （C）与对照相比，姐妹蜜蜂在用抗生素治疗时，CHC谱不同。 （D和E）接种活的，完整的微生物组接种物与热灭活接种物后，姐妹蜜蜂的肠道微生物群落（D）和CHC谱（E）不同。 （F至H）姊妹蜜蜂的肠道微生物群落（F）和CHC谱图（G）不同，并且当它们被来自两个不同菌落的年老蜜蜂接种时，但当第一次对老蜜蜂进行抗生素治疗（H）时没有区别。 数据显示为非度量多维标度图，描述了样本之间的BC不相似（C，E，G和H）或加权UniFrac（D和F）。 图例中的粗体字母表示统计意义，P <0.05（排列MANOVA后跟FDR成对对比）。

为了进一步测试微生物组在定义单个工蜂中CHC谱中的作用，我们通过向姐妹蜂中接种不同的肠道细菌来操纵它们的微生物组。 具体而言，将新出现的蜜蜂接种蜜蜂特有的共生菌Gilliamella apicola或机会性，环境获得性微生物Lonsdalea quercina接种16天（14，16）。

这两种肠道细菌都天然存在于我们研究中的觅食者的肠道中，并且可以在标准LB（Luria肉汤）培养基中轻松培养。 此外，apicola在蜜蜂肠道的糖代谢和植物多糖消化中起着重要作用-导致产生乙酰辅酶A和短链脂肪酸的过程，这些过程可能是CHC的前提 。 接种这两种细菌后，我们发现，除了发展出不同的肠道微生物群落外，这些特定细菌的丰度也不同，接种这些不同细菌的蜜蜂会形成不同的CHC谱图。 此外，实验室内的行为接受试验表明，接种共生蜜蜂的蜜蜂能够区分接种相同种型的蜜蜂和接种槲寄生的蜜蜂。

相比之下，用机会性L.quercina接种的蜜蜂无法区分接种相同系统型的姊妹蜜蜂与接种G.apicola的蜜蜂。 这表明共生微生物而非机会主义微生物赋予个体产生和感知巢式识别线索的能力。

因此，这些发现暗示了长期存在的神经伦理学难题的可能解决方案，该难题涉及如何将守卫蜂的化学感觉系统专门针对环境衍生的菌落特异性化学线索进行调节（3，20-25）：一些共生微生物可能会产生生理上的多效性因子 结合了嵌套识别提示的产生和感知。 虽然先前的研究支持在进化的时间尺度上通过遗传和遗传因素进行信息素生产和知觉的功能性耦合（26-31），但我们的数据表明，耦合也可能通过至少是在发育和/或生理时间尺度上发生。 部分是共生肠道微生物的作用。 然而，结合以上实验，这些发现表明，获得不同的微生物组足以驱动遗传相关个体之间独特的CHC谱的发展。

肠道微生物组在蜜蜂识别中发挥作用

（A）在实验室的LB平板上很容易培养G. apicola（黑色箭头）和quercina（绿色箭头）。 （B和C）蜜蜂在其肠道菌群中接种了不同的G. apicola（B）和CHC谱（C），而其姐妹蜜蜂接种了quercina。 （D）接种了apicola的蜜蜂能够区分接种相同系型的蜜蜂与接种quercina的蜜蜂。 （E）接种quercina的蜜蜂无法区分接种相同系统型的蜜蜂和接种apicola的蜜蜂。 （F）根据接种处理和起源菌落，在CHC谱图中接种了G.apicola或L.quercina差异的1号和2号蜜蜂。 （G）接种了apicola的菌落1蜜蜂接受接种apicola的菌落1和2蜜蜂并拒绝接种quercina的菌落1和2蜜蜂。 （A），（C）和（F）被描述为非度量多维标度图，描述了样本之间的BC不相似性。 图例中的粗体字母表示统计意义，P <0.05 [排列MANOVA（A，C和F）或Pearson卡方（B，D，E和G），后跟FDR成对对比]。 * P <0.05（皮尔逊的卡方）。

接下来，我们研究了共享的微生物群是否可以通过向两个不同菌落中新近封闭的蜜蜂接种G.apicola或L.quercina并通过实验室内行为接受分析来分析其CHC概况和行为，从而在无关的个体中诱导相似的CHC概况。 我们发现处理和源菌落均对这些蜜蜂的CHC谱有显着影响（图3F，使用BC的双向排列MANOVA，处理：F1,31 = 5.18，R2 = 0.13，P = 0.010;菌落： F1,31 = 4.77，R2 = 0.12，P = 0.015;处理*殖民地：F1,31 = 0.71，R2 = 0.02，P = 0.485）。 但是，行为研究表明，接种了apicola的蜜蜂会接受其他接种apicola的蜜蜂，并且会拒绝接种quercina的蜜蜂，这与遗传相关性无关。 总之，这些数据表明，肠道微生物群落的某些成员足以在不相关的蜜蜂之间驱动相似的巢式识别线索，从而进一步支持了肠道微生物组在表示蜂群中成员身份的化学标记作用中的作用。

先前的研究表明，蜜蜂肠道菌群的生物分类学多样性较低（32，33），因此，社区水平的变异可能不足以在整个独立菌落中形成独特的巢穴识别线索。 因此，我们假设单个微生物分类群的种群之间的功能遗传变异可为跨菌落的微生物依赖性提示差异提供更多机会。 以前的研究表明，apicola G. apicola菌株代谢各种碳水化合物的能力各不相同（17，18）。 由于微生物的碳水化合物代谢通常会产生短链脂肪酸和其他分子，宿主可利用这些分子合成CHC，因此这种常见蜜蜂肠道微生物菌株的遗传变异可能导致不同宿主CHC的发展。 型材（10）。

为了检验这个假设，我们首先通过对延伸因子Tu（tuf）的编码DNA序列进行测序，首先评估了来自四个不同蜜蜂群体的64种apicola G. apicola菌株在种群中的种群水平遗传多样性，该序列先前已用于 评估其他与蜜蜂有关的分类单元中的菌株多样性（32）。 通过所有菌株之间的成对序列比对，我们发现当存在于同一只蜜蜂中时，相比于来自同一菌落的不同蜜蜂，特定菌株的apicola G.api在遗传上更相似。 此外，来自不同殖民地的觅食蜜蜂之间的细菌菌株之间的距离远比来自同一殖民地的姐妹觅食者之间的细菌菌株之间的距离要远得多。

总之，这些数据表明常驻细菌系统型的不同菌株的遗传相关性与其寄主蜂的社会相关性相关。 此外，当从单一来源的殖民地新近封闭的蜜蜂群中接种遗传距离最远的四个G.apicola菌株之一时，它们会形成显着不同的CHC谱图。 同样，在行为分析中，接种的蜜蜂能够区分接种了不同菌株的姐妹蜜蜂和接种了相同菌株的姐妹蜜蜂。 总之，这些数据表明，蜜蜂肠道中至少一种常驻细菌系统型的菌株水平遗传多样性足以诱发其宿主识别线索的差异，这表明共生体遗传学可以驱动其动物复杂社会表型的变异。 主机。

应变水平的多样性与蜜蜂的CHC分布和识别能力的差异有关

（A）apicola编码基因tuf在不同殖民地的觅食蜜蜂之间比同一殖民地的蜜蜂具有更多的单核苷酸多态性（SNP）。 （B）接种了不同种类的apicola的姊妹蜜蜂会形成不同的CHC曲线。 （C）接种了apicola G. apicola 2或3的蜜蜂可以区分接种相同菌株的姐妹蜜蜂和接种不同菌株的蜜蜂。 （A）中使用Kruskall-Wallis进行统计，然后进行Dunn的成对对比显示为小提琴图，点表示中位数，线表示四分位数区域。 （B）中使用置换MANOVA和FDR成对对比的统计数据显示为非度量多维比例尺图，描绘了样本之间的BC不相似性。 （C）中的统计使用Pearson卡方。 图中的粗体字母（A）和图例（B）和星号（C）表示事后统计显着性（P <0.05）。

总体而言，我们在此处提供的数据表明，在蜜蜂中，巢菌识别提示是由特定于菌落的肠道微生物群落定义的。 对于这种情况如何发生，已经提出了几种机制。

一种选择是微生物组直接产生其昆虫宿主使用的提示。 尽管我们不能排除这种可能性，但先前的研究表明，蜜蜂巢状体的识别依赖于特定于菌落的CHC谱，该谱是由宿主的表皮下产生信息素的卵母细胞合成的。

因此，由于肠道微生物可能无法直接进入其宿主的卵母细胞，因此在蜜蜂中，微生物组更有可能通过提供或消耗前体代谢产物和/或调节表达来影响单个CHC谱的定量和定性方面。 CHC合成，半衰期和转运所涉及的宿主基因的活性或活性。 未来的功能研究可能会试图测试这些可能的机制。

科学家发现社交昆虫可以进化为利用共生细菌的遗传学作为强大且可靠的殖民地成员身份的代名词，这支持了全生命周期生物的概念，即宿主的基因组与其微生物群相互作用。 结合在其他社会膜翅目物种中的类似发现，这些数据表明，微生物组对识别线索的影响可能具有共同的祖先起源。 虽然导致社交膜翅目昆虫与其微生物群落之间共生关系的选择压力尚不清楚，但一种可能性是这种机制是通过共生而产生的。 例如，虽然巢穴识别对于社交昆虫寄主显然很重要，但它也可能对肠道微生物有益，因为寄主巢穴识别可以防止无关的动物入侵，这些无关的动物可以寄居并传播遗传上遥远的肠道细菌菌株。 因此，通过驱动宿主巢状体识别，一些肠道微生物可以减少与无关菌株的竞争。

虽然以前的大多数研究都集中在微生物组在蜜蜂健康和免疫中的作用，但我们的研究表明肠道微生物组在调节这种具有经济重要性的昆虫的社会行为特征方面也起着基本作用。 种类。 因此，随着越来越多来自不同动物群体的数据的出现，微生物群系对宿主行为的影响逐渐成为生活的基本规则，表明动物行为的某些方面以及人类的社会性 特别是可能是由于动物宿主与其共生微生物之间的强制性相互依存关系演变而来的。

在美国的密苏里州圣路易斯附近的两个地方，使用标准养蜂技术养育和管理蜜蜂（Apis mellifera）菌落：泰森研究中心和一处住宅。 为了减少在单个实验中使用的菌落之间的相关性，蜂王浆来自美国的不同地区，包括乔治亚州，加利福尼亚州（Isabees）和纽约州（Betterbee）。 为了从典型的蜜蜂群落中收集天然觅食者，通过在其后腿上的花粉负荷或由于花蜜负荷而使腹部膨大的方式来识别觅食者并进行收集。 对于包括实验室内处理或交叉寄养在内的所有实验，从菌落中取出带帽的育雏框架，并置于相对湿度为75％的32°C恒温箱中。

对于交叉培育实验（如图1E所示），来自两个独立来源菌落的约1000只新封闭的蜜蜂在其胸部标记了油漆斑点（Testors，Vernon Hills，IL，USA），然后各占一半 被随机地重新引入其来源或无关的寄养殖民地。 然后在重新引入后的第18天收集标记的蜜蜂作为回食的觅食者。 将所有用于化学分析的蜜蜂放入单独的1.7 ml微管中，然后快速冷冻。 在16S测序分析中使用的所有蜜蜂均用12.5％的漂白水洗涤一次，再用双去离子水洗涤两次（39），然后快速冷冻。 所有样品均储存在-80°C下直至进一步分析。

在实验室中处理过的蜜蜂，以50％的有机玻璃盒子（10×10×7 cm）（40）为一组，在相对湿度为75％的32°C恒温箱中饲养，并装有无菌花粉饼和悬吊，倒置，无菌的1.7。 含有经过特殊处理的25％（w / v）无菌糖（蔗糖）水的1 ml微管，每天更换一次。 为了测试25％糖水中的微生物存活率，我们将1.5μl25％糖水中的50μlapicola G.apicola培养物[OD600（光密度，600 nm）〜1]放置一夜，然后将其在标准LB板上接种至 确保增长。

此外，科学家在25％的糖水溶液中孵育了完整微生物群落的等分试样24小时，然后进行了16S rRNA测序（表S7）。 对于抗生素治疗，使用了三种干扰昆虫微生物的抗生素的混合物（41）。

抗生素原液（1000x）由水中的四环素（50 mg / ml），在二甲亚盘中的利福平（200 mg / ml）和水中的链霉素（100 mg / ml）组成。 然后，我们将50μl的每种储备溶液添加到50 ml的25％的糖水中，然后在每个处理日将1.5 ml的这种工作溶液添加到每个处理箱的新倒置微管中。 对于图2（A到C），将新出现的蜜蜂在其源菌落中放置3天以建立微生物组，然后将其重新收集并放入处理箱中，在那里他们接受25％的糖水或抗生素处理15天。 对于图2（G和H），从其原始菌落中收集觅食蜂并将其置于处理箱中，在其中接受25％的糖水或抗生素处理3天。 然后将这些蜜蜂中的10只一组转入新饲养的40只蜜蜂的新处理箱中，并用25％的糖水喂养16天。 对于活接种物的处理（图2，D和E），在无菌条件下解剖来自单个菌落的六只觅食蜜蜂中肠和后肠（39），在1 ml无菌25％糖水中匀浆，并于 每分钟2700转，持续1分钟，然后在每个处理盒的新倒置微管中将250μl上清液添加到1.3 ml 25％的糖水中。 对于热灭活处理，将剩余的上清液在95°C加热20分钟，然后在冰上冷却，然后将250μl加入新的倒置微管中的1.3 ml 25％糖水中，用于每个处理盒。 每个治疗日（17天）重复一次。 对于特定培养物的处理（图3和图4），将单个菌落在标准LB中培养过夜，使其OD值为〜1，然后放入冰箱。 在治疗期间每天（约15至20天），在每个处理盒的新倒置微管中，将50μl的这种培养物添加到1.5 ml的25％糖水中。 在所有情况下，每天都要从治疗箱中清除死蜂。 根据实验和存活率，将蜜蜂用于行为分析或用12.5％的漂白剂在水中清洗一次，再用双去离子水清洗两次（39）后，将它们放在治疗箱中直到14至21天大，然后快速冷冻 ，并保持在-80°C直至进一步分析。

科学家用实验室行为让蜂群接受分析

为了评估识别行为，我们对入侵者检测进行了修改（42，43）。 简而言之，按照上述规程，将来自单个菌落（图3，D和E）或两个菌落（图3G）的蜜蜂群分别接种apicola或queques L.quercina。 接种期后，将来自每种处理组之一的蜜蜂在潮湿的32°C恒温箱中，在培养皿中三只一组放置一整夜。

在试验当天，将这些陪替氏培养皿移至25°C的潮湿房间中，然后进行行为分析。 在这段时间内，将其他治疗组（未用于培养皿的蜜蜂）上的斑点涂上油漆，并放入单独的15 ml管中，直到进行行为分析。

这些蜜蜂充当“入侵者”，每只蜜蜂都被接种到一个培养皿中，蜜蜂接种了相同的系统型或不同的系统型。 对行为互动进行了录像10分钟，随后由盲人研究人员对录像进行了评分。 入侵蜂的得分为“拒绝”或“接受”，如果它们被至少一只蜜蜂叮咬和/或拖曳，则被视为拒绝，如果从未受到其他蜜蜂的侵略，则被视为接受。

美国科学家对蜜蜂的CHC提取和GC分析

通过将单个蜜蜂放入装有16毫米聚四氟乙烯（PTFE）/硅胶隔片螺帽（美国加利福尼亚州圣克拉拉的安吉伦特CrossLab）的6毫升玻璃小瓶中，从全部蜜蜂中提取CHC。 蜜蜂CHCs在500μl的含有十八烷（C18; 10 ng /μl）和六氢六烷（C26; 10 ng /μl）（MilliporeSigma，St.Louis，MO）的己烷中提取。 为了提取，将每个小瓶以最低速度轻轻涡旋（Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）2分钟。 将提取物立即转移到装有9毫米PTFE衬里盖的新的2毫升玻璃小瓶中（美国加利福尼亚州圣塔克拉拉市，Agilent CrossLab）。 如果实验涉及觅食性蜜蜂，则所有蜜蜂（包括非觅食性蜜蜂）在提取前均应去除后腿，以确保去除花粉。 将每种提取物一百微升转移至新的2毫升玻璃小瓶中，并保存在-20°C进行进一步分析； 剩余的400μl储存在-80°C作为备用。

首先通过组合气相色谱/质谱（GC / MS）分析已知年龄的觅食者和护士的代表性样本，以进行化合物鉴定。 样品以5°/ min的速度从150°（保持3分钟）运行到300°。 通过与合成化合物相比，它们的断裂方式鉴定化合物。 为了对单个蜜蜂进行轮廓表征，使用配备火焰离子化检测器（GC / FID）和可编程温度蒸发器的Agilent 7890A气相色谱系统对样品进行分析，并配备DB-1 20-m ×0.18毫米安捷伦121-1022熔融石英毛细管色谱柱（美国加利福尼亚州圣克拉拉，安捷伦科技公司）。 将1.0 µl的样品量注入色谱柱。 氦气是载气，以1 ml / min的恒定流速施加。 萃取物的分析是通过柱温曲线进行的，该温度曲线始于50°C（保持1分钟），然后以36.6°C / min的速度升至150°C，然后以5°C / min的速度升至280°C， 在那里举行了10分钟。 进样器温度和FID温度分别设置为280°C和300°C。 使用Agilent OpenLab CDS（EZChrom版）软件来计算保留时间和每个峰的总面积。 将数据归一化为已知量的内标十六烷（ng）。

肠道微生物组DNA提取，16S rRNA测序和分析

在无菌条件下在干冰上解剖冷冻的蜜蜂胆。 通过用一次性混合器无菌杵（VWR Products）浸软将单个蜜蜂的中肠和后肠均质化。 将匀浆物添加到PowerSoil珠溶液管（MO BIO）中，并按照制造商的说明使用DNeasy PowerSoil DNA分离试剂盒（MO BIO，卡尔斯巴德，加利福尼亚）提取DNA。 使用（44）中设计的引物和条形码通过聚合酶链反应（PCR）一式三份扩增16S rRNA基因的高变V4区。 测序之前，将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上显影，然后将不具有条带的样品移出进一步分析。 请注意，这些样品主要是接受抗生素治疗的样品或由接受抗生素治疗的年长蜜蜂饲养的样品。 所有样品均根据浓度进行合并，每个合并池均在Illumina MiSeq的单泳道上测序，具有2×250个碱基对的配对末端读数。

获得样品序列后，使用QIIME 2对序列进行多路分解，并使用DADA2在第一碱基处以质量得分<Q3截短配对末端的读段。 然后合并成对的末端读段，并使用DADA2鉴定“扩增子序列变体”（ASV）。 去除嵌合的ASV，并使用Greengenes数据库对其余的ASV进行分类（45）。 随后将样本数据重新分配到最低的合理样本读取数量。 从数据集中删除读取计数低于细数数量的样本。 通过国家生物技术信息基础本地比对搜索中心（NCBI BLAST），通过将代表性的ASV序列与蜜蜂相关微生物的基因组比对，对每个数据集至少五个样本中发现的ASV进行进一步的分类。

对于＃1测序库（在NCBI登录号PRJNA630281中找到相关样品），获得了1,723,236（861,618对）的总序列读数； 对798,864对信号进行了滤波和去噪； 710,716对被合并为非嵌合（82.4％）； 确定了233个ASV； 并将每个样本的数据鉴定为11,675个读数。 对于＃2测序库（在NCBI登录号PRJNA630292中找到相关样品），获得了1,429,358（714,679对）的总序列读数； 对692,814对信号进行了滤波和去噪； 672,361对被合并为非嵌合（94.1％）； 确定了633个ASV； 并将每个样品的数据稀有化为1794个读数。 对于＃3测序库（相关样品，登录号为NCBI，编号PRJNA630294），获得了1,280,076（640,038对）的总序列读数； 对606,799对信号进行了滤波和去噪； 582,712对被合并为非嵌合体（91％）； 确定了183个ASV； 并将每个样品的数据稀有化为1126个读数。

对实验结果统计分析

所有CHC分析均包括一组代表完善的蜜蜂CHC的19个峰，这些峰是通过将GC痕迹与已公开数据进行比较而鉴定的（46）。 为了比较CHC曲线，计算了每个样品中每种化合物的相对比例。 随后使用计算using =（��-min（�））/（max（�）-min（�））将每个CHC化合物中的这些数据重新缩放为0和1之间的值，其中包含了重新定标的值，以限制高表达的CHC对整体CHC轮廓的影响。 这些重新换算的值用于进一步的统计分析。 为了比较肠道微生物组数据，使用了ASV计数。 对于每个数据集，使用带有BC差异度量的R的纯素食包中的adonis函数运行置换MANOVA（47）。 随后在实验中进行了具有错误发现率（FDR）P值校正的成对比较，其中比较了两组以上。 使用非度量多维标度（R的素食主义者软件包中的metaMDS函数）可视化数据（47），使用CHC数据的BC不相似性或BC相似性或加权UniFrac（48，49），具体取决于哪种可视化方法最能描述统计比较，对于微生物组数据尤为重要。